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冻干技术与IVD试剂-第一章 基础知识（第五节 冻干保护剂） 在冷冻干燥配方中，除了活性组分和溶剂以外，还需要使用多种添加剂。这些添加剂有的被称为保护剂，有的被称为赋形剂，至今没有统一的叫法。"赋形剂"一词源于药剂学，原本是指构成药物或抗原的无活性物质辅料（例如阿拉伯胶、糖浆、淀粉），特别是在含有大量液体的药物混合物中，为了提高混合物的粘度以便于制备丸剂或片剂而加入的物质。然而，随着时间的发展，"赋形剂"这一名称的含义得到了扩展。 在冷冻干燥试剂的应用中，保护作用尤为重要，但在完成冷冻干燥后，其稳定的形态也是试剂稳定性的一个关键特征。一般来说，如果形态不佳，那么它的热稳定性往往也不理想。因此，许多蛋白试剂的配方中都需要添加赋形剂以确保形态的稳定性。在生物制品的冷冻干燥配方中，某些赋形剂只能发挥单一作用；而另一些则可以同时实现多个方面的功能。例如，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）既能作为低温保护剂，也能作为填充剂使用。对于保护剂在配方中的具体作用，有时候很难做出严格的区分。即便是同一种物质，在不同的冷冻干燥产品中也可能展现出不同的功能。
生物制品中的活性组分在降温与复温过程中可能会在一定的温度范围内发生变性。例如，对卵清蛋白的研究表明，在不添加保护剂的情况下，当温度降至-10℃至-40℃之间时，其活性会显著降低；而继续降温到-192℃时，活性几乎不会发生变化。在冷冻干燥过程中，主要有两种效应可能导致生物制品中的活性组分变性：冻结效应和脱水效应。 冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化以及相分离等）
脱水效应 在水溶液中，蛋白质分子表面通常被一层水分子所包围，称为水合层。而在大多数生物制品中，为了保证其稳定性，水的含量通常需要保持在3%以下，这意味着一部分结合水必须在干燥过程中被除去。结合水的去除很可能会破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白质变性。这是因为，当富含结合水的蛋白质分子在脱水过程中暴露于低水分环境中时，蛋白质表面的质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中的电荷平衡。电荷密度的降低可能会促进蛋白质分子之间的疏水相互作用，导致蛋白质聚集。因此，需要使用保护剂来替代结合水的功能，例如海藻糖和蔗糖就能起到这样的作用。 冻干试剂的存储 冻干试剂的存储相对于液体试剂来说更为简单，因为冻干试剂干燥、空间固定、成分稳定，对蛋白质的存储来说，这是最为安全的一种制剂形式之一。然而，冻干试剂在存储过程中也会遇到一些问题： 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变性的主要因素之一。蛋白质的凝聚可能是由于物理（非共价）相互作用，也可能是由于蛋白质发生化学凝聚（共价）。将试剂中的含水量控制在极低的水平，可以减少蛋白质的凝聚变性。 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中容易发生脱酰胺作用的两种氨基酸。 非酶褐变：也称为Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖）与蛋白质中的赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）形成碳水化合物复合物。 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys）、组氨酸（His）、色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）的残基侧链是可能发生氧化反应的位置。 水解作用：尽管冻干的蛋白质中含水量极低，但在贮藏过程中仍然可能发生水解作用。因此，控制整个工艺过程的含水量是保证试剂产品稳定性的最关键要素。 生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤的过程，冻结和脱水等多种效应会影响蛋白质的活性；即使成功完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，需要从物理的工艺过程和配方的功能两方面着手。 冻干保护剂 冻干保护剂是确保了活性组分在冷冻干燥及后续储存期间的稳定性和功能性。 按照保护剂的功能和性质，可以分为以下几类：
糖和多元醇 糖的主要组成元素是碳、氢、氧；而且其中氢和氧的比例总是2 ：1，恰好与水中氢和氧的比例相同，所以，糖类也被称为碳水化合物。糖类一般可分为单糖、低聚糖和多糖三类。单糖是糖类中不能再水解的化合物，是最小分子的糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖等；低聚糖指能被水解成2-10个单糖分子的糖，主要有蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖等；多糖指能被水解成更多的单糖和低聚糖的糖，主要有淀粉、纤维素、果胶等。 含有两个或两个以上羟基的醇统称为多元醇，又称糖醇（sugar alcohol）。在生物制品的低温冻结、解冻、冷冻干燥以及保存过程中，使用较多的是多元醇包括丙三醇（甘油）、山梨醇和甘露醇。由于糖和多元醇的官能团都是羟基，所以，它们用作低温保护剂和冷冻干燥保护剂时，具有一定的共性。 0 1 单糖 从理论上讲，在生物制品的冷冻干燥过程中，如果糖类与生物制品活性组分的分子形成氢键而替代了原有水的位置，那么，它对这些生物制品就能够提供保护作用。 而从我们的大量实验证明，单糖（如葡萄糖、半乳糖）对蛋白质的冷冻干燥过程不能起到保护作用，这是因为单糖在冻结过程中只能提供非常微弱的稳定作用，使得蛋白质在脱水干燥前就发生了不可逆变性。而相同浓度的海藻糖在冻结过程和脱水过程中却都能提供有效的保护作用。因此，生物制品的冷冻干燥配方中，一般不单独使用单糖作为保护剂，而是经常和其它赋形剂联用。 0 2 低聚糖 在许多生物制品的冷冻干燥过程中，常常采用低聚糖，尤其是二糖作为保护剂，这是因为二糖既能在冻结过程中起到低温保护剂的功能；又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。 二糖又分为还原性二糖和非还原性二糖，其中还原性二糖包括乳糖、麦芽糖等，非还原性二糖包括海藻糖和蔗糖等。 就冷冻干燥过程而言，无论还原性二糖还是非还原性二糖都具有很好的保护效果，但在生物制品冷冻干燥后的贮藏过程中，由于还原性二糖的存在会使得冻干品发生Maillard反应（蛋白质褐变反应），最终导致冻干品发生变质。所以，在食品、药品以及生物体的冷冻干燥配方中，蔗糖和海藻糖是最常用的两种保护剂。 海藻糖：是一种天然糖类, 是由特殊双糖分子构成的非还原性糖，非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。
0 3 多元醇 甘露醇：为白色结晶粉末，在水中易溶，在乙醇、乙醚中几乎不溶；熔点166-170℃，沸点290-295℃；在无菌溶液中较稳定，不易被空气氧化。在生物制品的冷冻干燥过程中，甘露醇一般用作填充剂，这是因为在慢速冻结时会结晶，从而为活性组分提供支撑结构；同时甘露醇也不会与活性组分发生反应。 山梨醇：是甘露醇的同分异构体，但其溶解度比甘露醇大，在常温下呈粘稠状透明液体，有旋光性；具有吸湿性，能溶解多种金属，高温下不稳定。在冷冻干燥配方中，山梨醇一般用作填充剂。 甘油（丙三醇）：为无色透明的粘稠状液体，熔点17.9℃，沸点290℃；吸水性强，能从空气中吸取水分；可以以任意比例与水、乙醇相混合，微溶于乙醚，不溶于苯、氯仿、四氯化碳和二硫化碳等有机溶剂，不溶于油脂。在冷冻干燥配方中，一般用作低温保护剂。 需要注意和充分验证的是，当糖/多元醇浓度提高到一定程度时，对蛋白质的稳定作用能力可能达到了极限，过高的浓度甚至会使得冷冻干燥过程中蛋白质发生变性。 聚合物类保护剂 聚合物是指由简单的小分子(称为单体)，经过聚合反应，所形成的巨大分子。其分子量通常相当大，可能含数千到数十万个原子。有的聚合物形成链状,有的形成网状。因此，聚合物具有能提高生物制品混合溶液的玻璃化转变温度等有利因素，因而在有些生物制品的配方中常常加入多种聚合物类保护剂。 聚合物类保护剂一般同时起着低温保护剂和脱水保护剂的作用。其中，最典型的的聚合物类保护剂有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、牛血清（BSA）、右旋糖苷（dextran）、聚乙二醇（PEG）等。聚合物类保护剂在一般情况下，在生物制品冷冻干燥配方中添加的聚合物具有以下的性质：
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：常被用作澄清剂、色素稳定剂和胶体稳定剂。PVP对生物材料的低温保存，和冷冻干燥，都是很好的保护剂。同时它在生物制品的脱水干燥过程中又是很好的填充剂，为生物制品提供很强的支撑作用。 牛血清白蛋白（BSA）：冷冻干燥粉末，常为白色或类白色；溶于水，其水溶液加热至60-70℃时蛋白会凝固沉淀。牛血清在很低的浓度下就能起到很好的保护效果，其保护作用原理与PVP一样。 右旋糖酐：右旋糖苷是若干葡萄糖分子脱水的聚合产物，又叫葡聚糖。抑制冰晶的长大，提供冷冻稳定性。右旋糖苷常被用作许多生物制品冷冻干燥的低温保护剂。 聚乙二醇（PEG）：乙二醇可与环氧乙烷作用生成聚乙二醇，聚乙二醇工业上用途很广，可用作乳化剂、软化剂、表面活化剂等。PEG在生物材料的低温保存和冷冻干燥过程中也是很有效的低温保护剂，其保护效果与PEG的分子量有关。在一定程度上，它的低温保护能力远远大于其它低分子化合物（如蔗糖）。 还有下面的聚合物，也会在冻干试剂的配方中使用：羟乙基淀粉、聚蔗糖、阿拉伯树胶、凝胶、纤维素、β -环式糊精、甲基纤维素、麦芽糊精、交联葡聚糖 等 表面活性剂类、氨基酸类的保护剂 0 1 表面活性剂类的保护剂 通常把凡是能降低界面张力的，由亲水和亲油基组成的化合物，称为表面活性剂。它们分子中的碳氢链部分是造成溶于油的原因；而分子中的极性基（如-COOH，-OH）则对水有亲和力。当这些分子处于空气—水界面或油—水界面时，亲水基会定位在水相，而亲油基则指向气相或油相。 表面活性剂可分为离子型和非离子型两大类。凡是溶于水时能电离成离子的，称为离子型表面活性剂；否则，称为非离子型表面活性剂。 在生物制品的冷冻干燥全过程中，表面活性剂既能在冻结和脱水过程中降低冰水界面张力所引起的冻结和脱水变性；又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用。 非离子型表面活性剂具有相对较低的临界胶束浓度，通常使用较低浓度就可以满足保护效果。其中吐温系列是最常用的非离子型表面活性剂，但需要强调：常温为液态的物料，必须充分验证对最终试剂形态的影响，形态结构不良的冻干试剂，大概率影响到试剂的热稳定性，而吐温对形态影响较大，因此如果产品有冻干后的分装要求时，不建议使用。 其他常用表活：曲拉通 X-100、蔗糖脂肪酸酯、羟丙基-β-环糊精、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚等。 0 2 氨基酸类的保护剂 氨基酸是蛋白质的基本构成单位，其中最主要的是α-氨基酸。它是由一个氨基（-NH2）、一个羧基（-COOH）、一个氢原子（-H）和一个R基团（-R）连结在一个α碳原子所组成。 由于氨基酸离子具有酸、碱两性，因此能够在生物制品的低温保存和冷冻干燥过程中能抑制溶液的pH变化，从而达到保护活性组分的目的。 此外，有许多氨基酸还是很好的填充剂。甘氨酸是最好的填充剂 。 其他添加剂 0 1 抗氧化剂 抗氧化剂的种类繁多，抗氧化的作用机理也不尽相同，但都以其还原性为依据。一种是抗氧化剂的自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧，使冻干样品物料不被氧化；另一种是抗氧化剂给出电子或氢原子，阻断冻干样品的氧化链式反应；还有一种方式是抗氧化剂通过抑制氧化酶的活性而防止冻干样品的氧化变质。将不同的抗氧化剂混合起来使用，比单独使用时，具有更高的效力，即混合抗氧化剂具有增效的作用。 常用的有：维生素E、维生素C、卵磷脂、D(-)-异抗坏血酸、L-抗坏血酸钠、硫代硫酸钠、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、格酸丙酯(没食子酸丙酯)、乙二胺四乙酸、二钠盐二水 等 0 2 缓冲剂 蛋白质具有两性电解质（amphoteric electrolyte）的性质，它既能和酸作用，又能和碱作用。当溶液在某一特定的pH值时，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，蛋白质不显电性，这时溶液的pH值称为该蛋白质等电点（isoelectric point）。蛋白质在它们的等电点的环境下更为稳定。然而在极端的pH的环境下，高静电荷引起强烈的分子内电推斥力，会导致蛋白质分子的展开。 由于在蛋白质溶液的冻结过程中，溶液的浓度逐渐提高。在高浓度时可能会改变溶液的pH值，严重情况下会导致蛋白质变性，从而直接使得生物制品失活。所以，在生物制品的冻干保护剂配方中，往往要添加适量的缓冲剂。 常用的缓冲剂：柠檬酸一水、磷酸、、乙烷磺酸、组氨酸、酷酸钾、柠檬酸钾、磷酸二氢钾、酷酸钠、碳酸钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、Tis base、Tis HCl。 0 3 冻干加速剂 冷冻干燥过程耗时长、耗能多，因此迫切需要对冻干循环进行优化，降低生产成本。在冻干配方中加入适量的叔丁醇（Tertiary Butyl Alcohol）后，冻结时会形成针状结晶；冰晶升华后，留下了管状通道，使水蒸汽流动阻力大大减小，升华速率显著提高。 叔丁醇是一种小分子醇，分子式为(CH3)3COH，与水完全互溶，具有低毒性、高蒸汽压，既可以单独作为冻干溶剂，又可以与水组成复合溶剂，目前的研究热点是叔丁醇-水复合溶剂。在药品水溶液中加入叔丁醇能起到以下作用：
而对于试剂产品来说，溶液量相对少，并且残留可能会带来一些其他影响，因此很少使用到。 保护剂的开发思路 通常产品需要根据不同的应用场景进行设计，有时还需要将试剂封装到特殊的结构中，这就要求冻干试剂具备不同的性能。因此，在开发试剂时，需要添加不同的辅料来满足工艺和应用场景的需求。
在冻干过程中，冻干配方通常是复合成分。低分子化合物和高分子化合物在保护活性组分方面各自扮演着不同的角色，这也是制备保护剂配方时通常将两者配合使用的原因。
低分子化合物和高分子化合物在冻干过程中各自具有独特的作用，将它们配合使用可以发挥出更好的保护效果。因此，在制备保护剂配方时，通常会将两者进行配合使用。 总结 保护剂的范围宽广，品种繁多，但没有一种十分理想的保护剂适用于所有情况。对于不同的冻干制剂，没有一个通用的保护剂配方，每种产品的适宜保护剂需通过反复试验才能确定。  ▼
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